卵子的心臟-紡錘體

2010-09-28
作者 Ashley

取卵手術結束,胚胎師正聚精會神地在顯微鏡下,茫茫大海裡找尋珍貴卵子。卵子正如同體內所有細胞一樣,有個最重要的染色體心臟,不同的是沒有核膜保護著,因為這時的染色體正處於準備分裂的預備階段,隱形但卻非常重要,希望擁有一雙透視眼,可以避免傷害到它,而將精蟲送入卵子體內順利受精。

一顆成熟的卵子(MII),除了在外表上會吐出第一極體(first polar body)外,其染色體心臟則停留在紡錘體階段(Spindle)。紡錘體由微小管(Microtubule)、中心體(Centrosome)、染色體所組成,在細胞分裂過程中,負責牽引在中間排列整齊的染色體往兩極化移動,所以當紡錘體或染色體排列出了問題或受到傷害,多半會影響胚胎發育或造成染色體異常。尚未成熟仍停留在第一次減數分裂的卵子,則無法觀察到紡錘體。 

然而紡錘體卻被許多不同的因子精密調控著。如:

(1) 年紀:有研究指出40~45歲卵子較20~25歲卵子更常出現微小管異常與染色體散亂現象。

(2) 溫度: (Ref 3)

2001年,孟利博士就曾觀察卵子紡錘體與溫度變化上的密切關係。發現當卵子離開溫度控制盤(heater)後,溫度自37℃快速下降至室溫曲線。此時紡錘體逐漸消失(A~C),直到回溫後10分鐘才部分恢復(D~F)。 

  1. A~C:卵子自37℃→31.9℃→27.1℃冷卻至室溫。
  2. D~F:卵子自室溫加熱至37℃,3、10、20 分鐘。

  1. 卵子維持在37、33、28、25℃,維持5分鐘、10分鐘,再度加溫至37℃,10、20分鐘後觀察。 
  2. 卵子持續在37℃過40分鐘,紡錘體也沒有改變。 
  3. 當溫度降至25℃再度加溫10分鐘,沒有任何一顆卵子恢復紡錘體(0/5)。 
  4. 溫度降至28℃再度加溫10分鐘,2/5可恢復。 
  5. 溫度降至33℃再度加溫10分鐘,5/5可恢復。 

因此我們得知卵子在室溫下10~30分鐘,紡錘體遭受巨大結構改變,包括體積變小、微小管消失、染色體分散等異常。回溫至37℃,則部份異常恢復,但仍有部份持續,這樣的卵子通常無法正常發育。

(3) 外界壓力如冷凍技術:過去曾經有許多研究探討卵子在冷凍過程中,是否會因冷凍保護劑或滲透壓改變而使紡錘體損傷,但在2010年最新研究指出,雖然不論慢速冷凍或玻璃化冷凍,皆會造成紡錘體暫時性消失,但隨著冷凍技術的進步,解凍後近96%卵子皆能恢復偵測到spindle。

(Ref4)卵子冷凍解凍不可避免地會造成spindle消失(A~C),但所有解凍的卵子中都可再度建構出spindle(D~E)。

(Ref5)經過慢速冷凍,spindle會暫時性消失,然而解凍後大部分皆可回復,尤其在37℃培養3~5小時後。

然而我們要如何透視這肉眼無法看見的紡錘體究竟位置在哪?型態看起來與實際上是否正常呢?目前較常使用的方式有以下兩種:

  1. 螢光共軛焦顯微鏡(Confocal microscopy):可清楚看到微小管與染色體的細節與結構(A, 綠色為紡錘狀的微小管、藍色為排列在中間的染色體);缺點是珍貴的卵細胞必須經過固定與染色,無法保持卵子存活,無法在臨床上使用。
  2. 偏光顯微鏡(Polscope):由於微小管為排列規則的結構,經過雙折射的偏光原理,在偏光顯微鏡下,會與細胞其他部分產生對比上的不同(B,白色霧狀為紡錘體),進一步偵測並轉換成圖像;優點是可即時觀測,並不傷害卵子細胞。

而在2010年四月,David F. Albertini等學者利用此兩種顯微鏡,觀察並比較成熟卵子紡錘體的正確結構。 

材料:

  1. 因不明原因或男性不孕症進行試管嬰兒的病人自願捐出的卵子。
  2. 長打療程,有吐出第一極體(first polar body, PB1)並沒有其他型態異常的MII卵(22顆)。
  3. 若沒有PB1也沒有GV的卵,則IVM繼續培養數小時等待PB1吐出(16顆)。
  4. 無異常型態卵子經慢速冷凍,解凍後兩個小時觀察(78顆)。
  5. Polscope:SpindleView; CRL。

結果:

作者將染色共軛焦顯微鏡所見的微小管與染色體結構分四級:

  1. spindle雙極化/染色體排列整齊(aligned chromosomes)
  2. spindle雙極化/染色體排列不整齊(nonaligned chromosomes)
  3. spindle不規則/染色體排列整齊(aligned chromosomes)
  4. spindle嚴重不規則或消失/染色體排列不整齊或消失

Fresh只有1顆無法利用Polescope看到spindle(2.6%;1/38),但經由Confocal則歸於telophaseI。

Thaw有6顆無法看見spindle(7.7% ; 6/78),其中1顆經Confocal歸類為C級、5顆為D級。  


  ABCD
新鮮(37) 35%(13/37) 54%(20/37) 5.5%(2/37) 5.5%(2/37)
經冷凍解凍後(78) 41%(32/78) 33%(26/78) 9%(7/78) 17%(13/78)

而就新鮮卵子中,一取出即成熟的卵子被歸在A級的有36.4%(8/22),略高於經過體外培養才成熟的卵子被歸在A級的比例31.2%(5/16)。

遲滯性(Retardance)為偏光顯微鏡中補償器主要測量的單位,可用來定量雙折射性質。作者欲透過偵測遲滯性,看是否能利用Polscope定量方式,得到與Confocal接近的結果。結果觀察到R值在解凍後卵子A~D組間有差異,新鮮卵子卻沒有統計上意義,推斷可能是樣本數太少。因此遲滯性的測量,對於微小管與染色體的排列,僅能提供有限的預測。 

結論:

曾有研究指出,可利用觀察紡錘體的雙折射,來作為有正常紡錘體結構或染色體排列的指標,可預測較佳的受精率與囊胚形成率。但當以共軛焦顯微鏡確認後發現,偏光顯微鏡可見紡錘體的卵子當中,也僅有35%染色體與微小管排列整齊,遲滯性(Retardance)也只有在高度不規則的紡錘體排列下,才有明顯異常,因此Polscope用來預測發育能力的功能似乎有限。

而Polscope不傷害到卵子,卻可觀察卵子次級結構,除了可以保護紡錘體不被顯微細針傷害,也可幫助透視卵子成熟度、挑選最佳的受精時間與位置,至今仍是最常用來觀察卵子紡錘體的工具,雖然不比共軛焦顯微鏡Confocal能提供視覺上高解析度的觀察,無法分辨出紡錘體的品質,但不需染色、不傷害卵子,可以重複觀察、提供動態偵測紡錘體的存在與位置,仍是目前臨床上無可取代的最佳工具。

 

參考資料

  1. http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/library/onlinebio/spindle.gif
  2. Coticchio G, Sciajno R, Hutt K, Bromfield J, Borini A, Albertini DF. Comparative analysis of the metaphase II spindle of human oocytes through polarized light and high-performance confocal microscopy. Fertil Steril 2010;93(6):2056-64
  3. Wang WH, Meng L, Hackett RJ, Odenbourg R, Keefe DL. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Hum Reprod 2001;16:2374-8
  4. Rienzi L, Martinez F, Ubaldi F, Minasi MG, Iacobelli M, Tesarik J, et al. Polscope analysis of meiotic spindle changes in living metaphase II human oocytes during the freezing and thawing procedures. Hum Reprod 2004;19:655-9
  5. Bianchi V, Coticchio G, Fava L, Flamigni C, Borini A. Meiotic spindle imaging in human oocytes frozen with a slow freezing procedure involving high sucrose concentration. Hum Reprod 2005;20:1078-83

評論

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  1.  "一顆卵子價值多少? " 這是我進入胚胎室學習培養時,深深撼動我的一句話。每顆卵子都可能在細心的呵護下,成為一個真實存在的生命。
  2. 但在卵子授精,形成胚胎的過程中,每一顆卵子細胞質的成熟度卻沒有一副3D眼鏡可以透視。看著每一顆外觀相似的卵子,在經過體外胚胎培養後總有著顯著差異存在,憑藉培養師臨床經驗外,若能加上紡錘體觀測儀的協助,在面對僅有少數珍貴卵子的卵巢衰竭 (DOR) 婦女上,確實能增加形成好囊胚的比例,將每一顆卵子的延續發揮至最大價值。
  3. e-stork 總是挑難走的路前進,因為挑戰高難度,卻也成就更大的幸福。門診中時常看到一天好幾台取卵手術,但實際上取出的卵子顆數總數卻少於10顆。在不斷自我要求下,硬體設備擴充、人員培訓更是與時俱進。您說送子鳥貴嗎 ? 高懷孕率及用心卻是無價!

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