想讓時間暫停，把人類生殖細胞（精子、卵子、胚胎）完美的冷凍保存，一直都是胚胎學家努力鑽研的方向。近幾年來，在冷凍保存方法上也陸陸續續有許多改良或嶄新方式提出，心心念念地就是希望能提高解凍後存活率與細胞健康度。

精蟲的冷凍目前已廣泛利用，不論是因化療、變性手術等不可逆因素，必需事先將自己生殖細胞保存下來；或集中捐贈者的精蟲提供無精症患者使用的精子銀行；或是進行人工生殖技術時，先生無法當天前來時，做預先的保留；甚至是防範於未然的觀念，尚未計劃生育時先冷凍下自己的生殖細胞等等。

而冷凍精蟲的方式，除了廣泛使用的傳統慢速冷凍法，亦發展出玻璃化快速冷凍法與透明帶冷凍技術，而此三種方式皆有其優缺點及適用對象，比較如下：

而目前針對一般狀況，最常使用的冷凍方式仍為傳統慢速冷凍法。雖說有可能在冷凍過程中因細胞內外形成冰晶、或是因抗凍劑滲透壓不同對細胞造成破壞性傷害，但因可以冷凍較大體積、較多數量的精蟲，仍是目前最常使用的方法。

冷凍的方法一直在進步與改良，但解凍的方法呢？ 2008年Juan等西班牙學者在Fertility and Sterility發表了篇研究，主要在探討不同解凍的溫度下，精蟲活動力恢復的狀況。

材料與方法：

1. 收集80位精液分析正常的捐贈者，液化後使用電腦輔助精液分析系統（CASA）進行檢測。
2. 部分精液事先使用密度梯度離心法（F45、F90）篩選精蟲後，將F90較優質的精蟲進行冷凍（F90）、部分精液直接進行冷凍（Semen）。
3. 慢速冷凍步驟：
   (1)將精蟲與冷凍保護劑（TES-TRIS citrate egg yolk glycerol）體積1：1一滴一滴混合，放入冷凍小管。
   (2)放置4℃ 1小時。
   (3)放置液態氮上層蒸氣中，30分鐘。
   (4)直接放入液態氮中。
4. 解凍步驟：
   (1)放入不同溫度20℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 水浴3分鐘。
   (2)期間輕柔搖晃使溫度均勻。

結果

1.在40℃解凍的組別，明顯活動力優於37℃組別；而有事先使用梯度離心法F90分離的亦同。



 

2.欲進一步探討活動力的差異是否與改變精蟲運動參數有關，則利用CASA分析系統，針對VAP（路徑速度）、VSL（直線速度）、VCL（軌跡速度）、ALH（精子頭側擺幅）、LIN（直線性）進行分析，結果顯示無顯著差異，因此解凍後活動力的差異並非藉由影響精蟲運動功能所造成。



3.增加解凍溫度擔心是否因溫度過高造成精蟲細胞膜氧化損傷，因此針對精蟲存活率、頂體的完整性進行檢測，而結果顯示不同解凍溫度組別間沒有顯著差異。

 

4.增加解凍溫度是否會影響精蟲DNA完整性，經由檢測發現並無顯著差異。

討論

1. 在精蟲冷凍保存上，雖然最佳解凍速度取決於冷凍速度，但有研究表示快速增溫通常可提高解凍後存活率，至今多使用37℃解凍精蟲。而本實驗第一個目的欲探討在20℃~40℃間解凍，對精蟲活動力的影響。
2. 本篇研究發現，解凍後精蟲活動力在40℃組別比37℃組別增加23.1%。
3. 由於精蟲活動力是一複雜的生物機械過程，因此作者利用CASA分析系統進行相關分析，但發現無顯著差異。
4. 精子細胞膜上含高量不飽和脂肪酸，並容易被自由基攻擊而造成脂質過氧化（lipid peroxidation），而造成細胞膜磷脂質的破壞、進而通透性增加、ATP損失、精蟲活動力下降。
5. 在解凍過程中自由基的生成增加，除了會造成細胞膜有關的細胞損傷外，也有研究顯示自由基可能會造成精蟲軸絲、核DNA的傷害。
6. 本實驗第二個目的則欲探討，不同溫度解凍後的精蟲，ATP含量與DNA完整性的差異性。
7. 本篇研究發現，精蟲生存能力、頂體狀態、DNA完整性、精蟲存活率在37℃與40℃實驗中皆無顯著差異。
8. 對於本篇研究觀察到40℃解凍後精蟲活動力優於37℃，作者提出的可能解釋，由於較高的解凍溫度，可能讓精蟲軸絲內的抗氧化酵素能力較快恢復，因此可比37℃更有效地中和解凍過程中所產生的自由基，而避免細胞損傷。
9. 雖然在37℃與40℃組別間，ATP的含量沒有差異，但在活動力恢復率>50%的樣本中，ATP含量的確有較高
10. 因為所測得的ATP穩定態含量代表生成與使用的平衡，故也不能排除40℃解凍是否會藉由保護軸絲內不被自由基攻擊，進而影響ATP的生成或使用
11. 此篇研究提供我們在解凍精蟲流程上新的觀念與想法，但仍需更多的實驗證實，並且須再探討40℃解凍的精蟲，在受精率、懷孕率、人工受孕上是否與37℃有所差異。